تهیه کیتوزان با کیتین های تولیدی از میگو با استفاده از دو اسید متفاوت و تعیین درجه استیلاسیون با استفاده از طیف ftir

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه علوم و زیست‌فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

2 استادیار گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران. *(مسوول مکاتبات)

چکیده

کیتین بعد از سلولز فراوان­ترین پلی­ساکارید یافت شده در طبیعت است که در پوسته سخت­پوستان، اسکلت خارجی حشرات، نماتد­ها، جلبک­ها و دیواره سلولی قارچ­ها به صورت کمپلکس با سایر پلی­ساکارید­ها و پروتئین­ها یافت می­شود. پلیمر خطی کیتوزان با زمینه کاربرد فوق العاده بالا از پزشکی گرفته تا کشاورزی، از مشتقات کیتین است که از طریق داستیلاسیون کیتین تولید می­شود. در این مطالعه کیتین با درصد­های متفاوتی از دو اسید صنعتی از پوسته میگو تهیه شد و خصوصیات عملکردی کیتوزان تهیه شده از این نمونه­ها توسط طیف­سنج­های تبدیل فوریه (FTIR1)مطالعه شد. الگوی FTIR نمونه­ها تقریبا با نمونه­های استاندارد مطابقت داشتند. همچنین تهیه فیلم کیتوزان و بررسی طیف IR آن نشان داد که کیتوزان به دست آمده دارای درجه استیلاسیون بین 22-18 می­باشد. نظر به وفور میگو در بخش­های جنوبی و شمالی کشور، راه­اندازی خط تولید این ماده بسیار پربها امکان­پذیر می­باشد که در رشد اقتصادی و، با جایگزینی
 این ماده با مواد شیمیایی ناسازگار با محیط زیست، در حل مشکلات زیست محیطی جوامع انسانی موثر می­باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


 

 

 

 

 


 

 

فصلنامه انسان و محیط زیست، شماره 49، تابستان 98

 

تهیه کیتوزان با کیتین­های تولیدی از میگو با استفاده از دو اسید متفاوت و تعیین

 درجه استیلاسیون با استفاده از طیف FTIR

 

معصومه کردی[1]

ناصر فرَخی 2*

Nfarrokh@nigeb.ac.ir

 

 

تاریخ دریافت: 22/12/1394

تاریخ پذیرش:15/10/1395

 

چکیده

کیتین بعد از سلولز فراوان­ترین پلی­ساکارید یافت شده در طبیعت است که در پوسته سخت­پوستان، اسکلت خارجی حشرات، نماتد­ها، جلبک­ها و دیواره سلولی قارچ­ها به صورت کمپلکس با سایر پلی­ساکارید­ها و پروتئین­ها یافت می­شود. پلیمر خطی کیتوزان با زمینه کاربرد فوق العاده بالا از پزشکی گرفته تا کشاورزی، از مشتقات کیتین است که از طریق داستیلاسیون کیتین تولید می­شود. در این مطالعه کیتین با درصد­های متفاوتی از دو اسید صنعتی از پوسته میگو تهیه شد و خصوصیات عملکردی کیتوزان تهیه شده از این نمونه­ها توسط طیف­سنج­های تبدیل فوریه (FTIR1)مطالعه شد. الگوی FTIR نمونه­ها تقریبا با نمونه­های استاندارد مطابقت داشتند. همچنین تهیه فیلم کیتوزان و بررسی طیف IR آن نشان داد که کیتوزان به دست آمده دارای درجه استیلاسیون بین 22-18 می­باشد. نظر به وفور میگو در بخش­های جنوبی و شمالی کشور، راه­اندازی خط تولید این ماده بسیار پربها امکان­پذیر می­باشد که در رشد اقتصادی و، با جایگزینی

 این ماده با مواد شیمیایی ناسازگار با محیط زیست، در حل مشکلات زیست محیطی جوامع انسانی موثر می­باشد.

کلمات کلیدی: کیتین، کیتوزان، FTIR، درجه استیلاسیون.


 

Human & Environment., No. 49, Summer 2019

 

 

 

 


Production of chitosan from shrimp producted chitin with two acids and determination degree of acetylation by FT-IR spectroscopy

 

Masoumeh Kordi [2]

Naser Farrokhi *[3](Corresponding Author)

Nfarrokh@nigeb.ac.ir

 

Abstract

After cellulose, chitin is the most abundant polysaccharide found in nature. Chitin has been found in the shells of crustaceans, exoskeleton of insects, nematodes, and fungi cell wall in complex forms with other proteins and polysacharids. Chitosan produced by deacetylation of chitin and used in medico until agriculture. The chitin with different percentages of industrial acid was prepared from shrimp shells and functional properties of chitosan prepared from these samples by Fourier transform (FTIR) was studied. FTIR pattern almost matched samples with standard samples. The preparation of chitosan film and its IR spectrum showed that the degree of acetylation of chitosan obtained between 22-18 liable by Brugnerotto and coworker (2001) method. In view of shrimp abondance in northern and southern parts of the country, the commissioning a very precious product line is the possibile that economic growth and replacing with chemicals incompatible with the environment in solving the environmental problems of human societies is the most effective.

Key Words: Chitin, Chitosan, FTIR, Acetylation degree.

 

 

 

 

 


مقدمه

 

کیتین پس از سلولز فراوان­ترین پلی­ساکارید طبیعی است که در ساختار آن واحد­های (N-acetylglucosamine) 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose با پیوند­های (41) β بهم متصل می­شوند. کیتین اغلب به عنوان یکی از مشتقات سلولز بررسی شده است، با آن­که کیتین در موجودات تولید کننده سلولز وجود ندارد. کیتین از نظر ساختاری همانند سلولز است، اما در موقعیت کربن شماره 2 گروه­های استامید acetamide (-NHCOCH3) دارد. به طور مشابه کیتوزان که از مشتقات کیتین است، پلی­مری خطی از واحد­های 2-amino-2-deoxy- β-D-glucopyranose است که با پیوند­های (41) α به هم متصل شده­اند، و با N- داستیلاسیون کیتین تولید می­شود، میزان تغییر آن توسط درجه داستیلاسیون مشخص می­شود، و بنابراین یک کوپلیمر از N- استیل­گلوکزآمین و گلوکزآمین است (1). این مواد بیولوژیک کاربردی جدید، پلیمر­هایی با پتانسیل بالا هستند که در صنایع مختلف داروسازی (2)، کشاورزی، صنایع غذایی (3)، تولیدات گیاهی، پالایش آب (4)، زیست فناوری، پزشکی (5)، کاغذسازی، پالایش فلزات سنگین، تغذیه حیوانات، شیمی فیبر و نساجی (7) کاربرد دارند.

تا به حال بیش از 300 منبع مختلف از انواع بی­مهرگان و گیاهان دریایی، جلبک­ها، باکتری­ها، حشرات، قارچ­ها، مخمر­ها و غیره برای استخراج این مواد مورد بررسی قرار گرفته­اند.

در حال حاضر پوسته میگو خرچنگ و کریل منابع اصلی استخراج این مواد است (8). میزان نیاز جهانی کیتین 150000 تن در سال برآورد شده در حالی­که میزان تولید فعلی آن 3000 تن در سال می­باشد (8). عدم امکان تولید بیش­تر به دلیل محدودیت منابع قابل دسترس و فصلی بودن صید سخت­پوستان می­باشد (8). نظر به اهمیت و کاربرد­های فراوان این مواد، دست­یابی به درصد محصول بالا با کیفیت مطلوب مدنظر بسیاری از کشور­ها می­باشد.

 

مواد و روش­ها

این تحقیق در آزمایشگاه شیمی دانشگاه شاهرود در 1394 اجرا گردید. مواد مورد استفاده از قبیل NaOH، HCl و KBr از شرکت مرک (آلمان) خریداری شدند. طیف IR با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مادون قرمز FTIR مدلRAYLEIGH WQF-510A  از نمونه­های کیتوزان گرفته شد.

در این پژوهش از پوسته­های مربوط به میگو استفاده شد، پوسته­های مذکور از عمده فروشی­های میگو تهیه گردید .در مرحله بعد پوسته­ها با آب به­طور کامل شستشو شد و بقایای گوشت میگو و احشاء داخلی میگو کاملا از آن جدا گردید. سپس پوسته­ها در آون در دمای 4۰ درجه سانتی­گراد خشک گردید، بعد با آسیاب به پودر تبدیل شد. آنگاه استخراج کیتین از پوسته­ها طی مراحل زیر به روش Takiguchi (1991) صورت گرفت (9). خالص­سازی کیتین: پوسته­ها جهت پروتئین­زدایی در محلول سودسوزآور 1 نرمال در دمای اتاق برای مدت 24 ساعت قرار داده شد. بقایای پوسته روی کاغذ صافی ریخته شد و مواد باقی مانده روی کاغذ صافی تا رسیدن به pH خنثی با آب مقطر شستشو گردید. کانی­زدایی از پوسته­های میگو به مدت 24 ساعت در محلول اسید کلریدریک 1 نرمال و 2 نرمال و اسید لاکتیک 1 نرمال و 2 نرمال با نسبت­های پوسته به اسید 1:10، 1:15 و 1:25 در دمای اتاق روی هم­زن انجام شد. سپس بقایای پوسته صاف شد و مواد باقی­مانده روی کاغذ صافی تا رسیدن به pH خنثی با آب مقطر شستشو گردید (شکل 1). کیتوزان حاصل دی­استیلاسیون کیتین است. فرآیند دی­استیلاسیون کیتین در دمای 100 درجه سانتی­گراد به مدت 6 ساعت درون محلول سود غلیظ 50 درصد انجام شد. سپس مواد معلق در محلول سود روی کاغذ صافی ریخته شد و با آب مقطر تا رسیدن به pH خنثی شستشو شدند. آنگاه کیتوزان بدست آمده در آون با دمای 60 درجه سانتی­گراد خشک شد (10).

 

 


شکل 1- مراحل تولید کیتوزان از پوسته میگو. الف) میگو با پوست ب) پوسته­های شسته و خشک شده میگو ج) کیتوزان استحصال شده از پوسته میگو.

 

 

کاغذ صافی ریخته شد و با آب مقطر تا رسیدن به pH خنثی شستشو شدند. آنگاه کیتوزان بدست آمده در آون با دمای 60 درجه­سانتی­گراد خشک شد (10). پس از آن­که بر روی پوسته­های میگو مراحل کانی­زدایی، حذف مواد پروتئینی، لیپیدی و مرحله داستیلاسیون و تولید کیتوزان انجام شد. درصد محصول با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

درصد استحصال کیتوزان = وزن کیتوزان تولیدی ÷ ( وزن اولیه پوسته میگو × 100)

تعیین درجه استیلاسیون کیتوزان: در این آزمون برای تعیین درجه استیلاسیون از اسپکتروفتومتر مادون قرمز FTIR)) استفاده شد. برای تعیین درجه استیلاسیون کیتوزان طبق روش Brugnerotto و همکاران (2001) از میزان جذب نمونه     در طول موج­های 1320 و 1420 cm-1 استفاده شد (11)، باند 1320 cm-1 باند اختصاصی برای N- استیل­گلوکزآمین است. طبق تحقیق Garcia و همکاران (1983) در باند 1420 cm-1 به طور آشکاری بین نمونه کیتین و کیتوزان تفاوت وجود دارد (12).

به منظور گرفتن طیف IR نمونه­ها، مقدار 15 میلی­گرم از پودر نمونه کیتوزان با مقدار کافی از پودر KBr مخلوط و             با استفاده از دستگاه پرس مخصوص ساخت قرص،   تحت فشار قرار گرفت و به صورت قرص درآمد و در دمای اتاق برای آزمایش­های اسپکتروفتومتری مادون قرمز در دامنه طول موج  400 تا 4000 cm-1 ثبت شد. طیف زمینه به طور اتوماتیک از طیف نمونه کسر شد.

نتایج و بحث

تیمار­های مختلفی که برای تولید کیتین و کیتوزان           مورد استفاده قرار گرفت شامل درصد سود و اسید مصرفی و مدت زمان تیمار نمونه­ها با این دو ماده بود، که به طور خلاصه در جدول 1 آورده شده است، این جدول شامل درصد محصول کیتوزان تولیدی با دو اسید صنعتی متفاوت لاکتیک اسید و هیدروکلریک اسید و سود سوز آور 1 نرمال و همچنین درجه استیلاسیون نمونه­ها می­باشد

نتایج حاصله نشان داد که درصد استحصال کیتوزان به روش­های مختلف بین 8 تا 19 درصد می­باشد که این درصد­ها با درصد­های تولید محصول آزمایشات Chang و همکاران (1997) و Heu و همکاران (2003) مطابقت دارد (13و 10). درصد تولید محصول در کیتوزان تولیدی از کیتین تهیه شده    با لاکتیک اسید کم­تر از کیتین حاصل از هیدروکلریک­اسید بود که، این تفاوت احتمالا دلیل پروتئین­زدایی غیر کامل هیدروکلریدریک­اسید نسبت به روش لاکتیک­اسید می­باشد. درجه استیلاسیون نمونه­ها بعد از انجام طیف­سنجی با دستگاه طیف­سنج تبدیل فوریه و اندازه­گیری میزان جذب در طول موج­های مشخصی به روش Brugnerotto و همکاران (2001) محاسبه گردید. تغییرات درجه استیلاسیون به دلیل تفاوت موجود در طیف FTIR نمونه­ها می­باشد. جهت شناسایی دقیق تفاوت­های بین طیف­های FTIR (مخصوصا طول موج­های مورد نظر برای اندازه­گیری درجه استیلاسیون) حاصل از نمونه­های مختلف باید طیف­ها را بر هم منطبق کرد تا بتوان تفاوت­های بین آن­ها را مشاهده کرد. البته اختلاف کم بین این نمونه­ها را به شکل بهتر می­توان در مقادیر جذب نمونه­ها در طول موج­های مختلف، که از دستگاه FTIR در قالب جداولی در Excel ارایه می­شود نیز مشاهده کرد. همان­طور که در جدول 1 مشاهده می­شود.

در مطالعه Beany و همکاران (2005) درجه استیلاسیون نمونه­های کیتین و کیتوزان تولید­شده از پوسته میگو با روش Brugnerotto و همکاران (2001) محاسبه شد، که درصد استیلاسیون نمونه­های کیتین بین 71-67 و درجه استیلاسیون نمونه­های کیتوزان بین 19-17 محاسبه گردید (14).          در مطالعه حاضر درجه استیلاسیون نمونه­های کیتوزان (22-18 درصد) نزدیک به درجه استیلاسیون در تحقیق Beany و همکاران (2005) محاسبه گردید. برای طیف FTIR کیتوزان استاندارد هفت پیک اصلی در دامنه 893، 1021، 1255، 1420، 1581 و 3404 cm-1 ثبت شده است. نمونه­ای از طیف­های FTIR گرفته­شده از کیتوزان در شکل 2 ارایه شده است. آبزیان تولیدی در اکوسیستم عظیم دریا ارزان­ترین و اقتصادی­ترین غذای مردمان جهان را می­سازند. میگو، خرچنگ و لابستر از مهم­ترین آبزیان هستند که هر ساله صید هزاران تن از آن­ها ضایعات بسیاری در کارخانجات عمل­آوری به جا می­گذارد. کیتین از مهم­ترین اجزا این ضایعات است که کاربرد­های    بسیار گسترده­ای دارد. عمده این مراکز از ارزش واقعی این زباله­ها بی­اطلاعند. اما امروزه نیاز­های روز افزون جامعه بشری در کنار پیشرفت برق­آسای شاخه­های مختلف علوم کاربردی سبب شده، آن­چه از نظر بعضی زباله متعفن و مسبب آلودگی محیط زیست شناخته می­شد، اکنون یکی از ارکان توسعه صنایع دارویی و بهداشتی محسوب گردد. کیتین ماده خام فراوانی است که برای تبدیل به مواد شیمیایی و محصولات جدید عملا تمام نشدنی است. امروزه کیتین و کیتوزان به عنوان بیوپلیمرهای اختصاصی بیوتکنولوژی مطرح هستند. این نوع ماده زیستی به علت برتری­ها و مزیت­های ذاتی، آینده درخشانی دارند. هزینه تولید کیتوزان در مقایسه با کاربرد­های فراوان و قیمت گران آن، پایین و استخراج کیتوزان از ضایعات سخت پوستان در کشور ما از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است و در صنایع مختلف همچون زیست­فناوری، کشاورزی، صنایع غذایی، پزشکی، داروسازی، منسوجات، بهداشتی و آرایشی، دارویی، صنعت و غیره کاربرد دارد و استفاده از آن گامی موثر در حل مشکلات زیست محیطی کشور به شمار می­رود.

سپاسگزاری

نویسندگان از کارشناس محترم آزمایشگاه شیمی          دانشگاه شاهرود، سرکار خانم دکتر راحله دوستی به خاطر راهنمایی­های ارزشمندشان کمال تشکر و قدردانی را دارند.


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- روش تولید کیتین و کیتوزان به همراه درجه استیلاسیون و درصد استحصال نمونه­های کیتوزان

لاکتیک اسید

اسید­کلریدریک

پارامترها

 

 

1 نرمال

2 نرمال

1 نرمال

2 نرمال

غلظت اسید

1:25

1:15

1:10

1:25

1:15

1:10

1:25

1:15

1:10

1:25

1:15

1:10

نسبت پوسته به اسید

سدیم هیدروکسید 1 نرمال

سدیم هیدروکسید 1 نرمال

غلظت سود

16/88%

17/34%

16/53%

8/25%

10/28%

15/05%

18/48%

19/2%

19/04%

12/26%

17/06%

16/64 %

درصد استحصال کیتوزان

20/263

19/530

20/503

20/235

19/858

19/436

18/109

19/363

19/96

22/46

19/7

19/4044

درجه استیلاسیون کیتوزان

                             

 


 

شکل 2- طیف FTIR گرفته شده از نمونه کیتوزان تهیه شده با استفاده از اسید لاکتیک 2 نرمال و سود 1 نرمال با نسبت 1:25 با دستگاه FTIR مدلRAYLEIGH WQF-510A  می­باشد.

 

منابع

 

  1. Dutta, P.K., Dutta, J., Tripathi, V., 2004. Chitin and chitosan: chemistry, properties and applications. Journal of Scientific & Industrial Research, Vol. 63, pp.20-31.
  2. Ilium, L., 1998. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharmaceutical Research, Vol. 15, pp.1326–1331.
  3. Chien, P.J., Sheu, F., Yang, F.H., 2007. Effects of edible chitosan coating on quality and shelf life of sliced mango fruit. Journal of Food Engineering, Vol. 78, pp.225–229.
  4. Ramnani, S.P., Sabharwal, S., 2006. Adsorption behavior of Cr(VI) onto radiation cross linked chitosan and its possible application for the treatment of wastewater containing Cr(VI). Reactive and Functional Polymers, Vol. 66, pp.902–909.
  5. Mao, H.Q., Roy, K., Troung-Le, V.L., Janes, K.A., Line, K.Y., Wang, Y., 2002. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: Synthesis, characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release, Vol. 70, pp.399–421.
  6. Alder, E., 1997. Chitin natural macromolecules. Chem. of Macromolecules. Internet. Pdf. http://www.seaborne.com/chitinguide.htm. p.10.
  7. Pagel, D., 1999. Chitin Production from Lobster and Crab in: NatlAcdemy Press, Island., pp. 61-68.
  8. Takiguchi, Y., 1991. Chitosan-Jikken Manual, Advances in chitin science, Proceedings from the Asia-Pacific. In: Chen R.H. and Chen H. C. (ed) Physical properties of chitinous material Chitin, Gihodou Shupan Kabushki Kaisha, Japan, pp.1-7.
  9. Chang, K.L., Tsai, G., 1997. Response surface optimization and kinetics of isolating chitin from pink shrimp (Solenocera melantho) shell waste. J. Agric. Food Chemistry, Vol. 45, pp.1900-1904.
  10. Brugnerotto, J., lizard, J., Goycoolea, F.M., Monal, W.A., Desbrieres, J., Rinaudo, M., 2001. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer, Vol. 42, pp. 3569-3580.
  11. Garcia Alonos, I., Peniche-Covas, C., Nieto, J.M., 1983. Determination of The Degree of Acetylation of Chitin and Chitosan by Thermal analysis. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 28, pp.189-193.
  12. Heu, M.S., Kim, J.S., Shahidi, F., 2003. Components and nutritional quality of shrimp processing by products. Food Chemistry, Vol. 82, pp.235-242.
  13. Beaney, P., Mendoza, J.L., Healy, M., 2005. Comparison of chitins produced by chemical and bioprocessing methods. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, Vol. 80, pp.145-150.

 

 



1- دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه علوم و زیست­فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

2- استادیار گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران. *(مسوول مکاتبات)

1- PhD student in Agricultural Biotechnology, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences & Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran.

2- Assistant Professor at Department of Cell & Molecular Biology, Faculty of Life Sciences & Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran. *(Corresponding Author)

 

  1. Dutta, P.K., Dutta, J., Tripathi, V., 2004. Chitin and chitosan: chemistry, properties and applications. Journal of Scientific & Industrial Research, Vol. 63, pp.20-31.
  2. Ilium, L., 1998. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharmaceutical Research, Vol. 15, pp.1326–1331.
  3. Chien, P.J., Sheu, F., Yang, F.H., 2007. Effects of edible chitosan coating on quality and shelf life of sliced mango fruit. Journal of Food Engineering, Vol. 78, pp.225–229.
  4. Ramnani, S.P., Sabharwal, S., 2006. Adsorption behavior of Cr(VI) onto radiation cross linked chitosan and its possible application for the treatment of wastewater containing Cr(VI). Reactive and Functional Polymers, Vol. 66, pp.902–909.
  5. Mao, H.Q., Roy, K., Troung-Le, V.L., Janes, K.A., Line, K.Y., Wang, Y., 2002. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: Synthesis, characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release, Vol. 70, pp.399–421.
  6. Alder, E., 1997. Chitin natural macromolecules. Chem. of Macromolecules. Internet. Pdf. http://www.seaborne.com/chitinguide.htm. p.10.
  7. Pagel, D., 1999. Chitin Production from Lobster and Crab in: NatlAcdemy Press, Island., pp. 61-68.
  8. Takiguchi, Y., 1991. Chitosan-Jikken Manual, Advances in chitin science, Proceedings from the Asia-Pacific. In: Chen R.H. and Chen H. C. (ed) Physical properties of chitinous material Chitin, Gihodou Shupan Kabushki Kaisha, Japan, pp.1-7.
  9. Chang, K.L., Tsai, G., 1997. Response surface optimization and kinetics of isolating chitin from pink shrimp (Solenocera melantho) shell waste. J. Agric. Food Chemistry, Vol. 45, pp.1900-1904.
  10. Brugnerotto, J., lizard, J., Goycoolea, F.M., Monal, W.A., Desbrieres, J., Rinaudo, M., 2001. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer, Vol. 42, pp. 3569-3580.
  11. Garcia Alonos, I., Peniche-Covas, C., Nieto, J.M., 1983. Determination of The Degree of Acetylation of Chitin and Chitosan by Thermal analysis. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 28, pp.189-193.
  12. Heu, M.S., Kim, J.S., Shahidi, F., 2003. Components and nutritional quality of shrimp processing by products. Food Chemistry, Vol. 82, pp.235-242.
  13. Beaney, P., Mendoza, J.L., Healy, M., 2005. Comparison of chitins produced by chemical and bioprocessing methods. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, Vol. 80, pp.145-150.